zui大速度方法

（1）移動(dòng)界面超速離心法

含幾個(gè)組分的樣品在足夠高的離心場中離心時(shí)，每種顆粒都達(dá)到其zui大沉降速度，這時(shí)樣品開始分離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液，并形成對應(yīng)于樣品各組分的一系列濃度界面，界面的移動(dòng)相對于每種組分來說是特征的。

雖然利用這種方法不一定能實(shí)現(xiàn)組分的純化分離，但可以通過監(jiān)測界面的移動(dòng)來測定各組分的沉降速度。要想實(shí)現(xiàn)組分間的分離，必須在所需樣品沉降之后停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中，并以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降，而被純化的樣品留在溶液中，經(jīng)過反復(fù)多次地離心才能得到純的樣品，這種方法就叫差示沉降離心法，它對細(xì)胞組分間的分離非常有用。也可以通過逐漸增大轉(zhuǎn)速的方法實(shí)現(xiàn)不同組分間的分離，如圖1。

圖1 細(xì)胞勻漿差示分離的示意圖

（a）細(xì)胞勻漿；（b）細(xì)胞碎片；（c）線粒體、過氧化物酶體、溶酶體；（d）微粒體、核糖體；（e）細(xì)胞液；（可溶性蛋白質(zhì)及小分子生物）

（2）移動(dòng)區(qū)帶超速離心法

差示離心法離心前各組分均勻分布在整個(gè)溶液中，所以分離一般不理想，而移動(dòng)區(qū)帶超速離心法是一種密度梯度（Dens 心Gradient）離心技術(shù)，在離心之前離心管 中溶液的密度不同（從上到下密度增大），梯度介質(zhì)中zui大密度應(yīng)小于樣品物質(zhì)的zui小密度，其特點(diǎn)是物質(zhì)的分離取決于樣品物質(zhì)顆粒的質(zhì)量．即樣品物質(zhì)的沉降系數(shù)，而不是取決于樣品物質(zhì)的密度，因而適合于分離密度相近而大小和形狀不同的物質(zhì)，這屬于一種非平衡態(tài)分離法。當(dāng)樣品物質(zhì)輕輕地鋪在密度梯度介質(zhì)的液面上，起動(dòng)離心機(jī) ，在離心力的作用下，一定時(shí)間后便形成不同物質(zhì)的區(qū)帶。當(dāng)繼續(xù)離心時(shí)每個(gè)區(qū)帶會(huì)逐一達(dá)到管底，所以，在沉降zui快的區(qū)帶到達(dá)管底之前要停止離心，并將每個(gè)區(qū)帶分部收集。zui常用的制備密度梯度的化合物有蔗糖、氯化銫和硫酸銫等。

等密度方法

等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質(zhì)的密度相等，實(shí)際上是在梯度密度介質(zhì)中進(jìn)行的。該技術(shù)的特點(diǎn)是沉降分離與樣品物質(zhì)的大小和形狀無關(guān)，而取決于樣品物質(zhì)的密度。這種方法非常類似于電泳中的PH 梯度等電聚焦方法，在離心時(shí)，顆粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移動(dòng)到與自身的密度相同的溶劑梯度中為止，其結(jié)果是依樣品物質(zhì)密度的不同在梯度溶劑中形成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。

在實(shí)驗(yàn)方法上可以采用預(yù)先制備密度梯度溶液的方法，一般先制備兩種儲(chǔ)備液，它們的濃度決定zui終所形成梯度溶液的極限。可以通過分步減小密度，從離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續(xù)梯度溶液，也可以通過一個(gè)梯度混合器產(chǎn)生連續(xù)梯度密度。儲(chǔ)備液一般使用兩種密度的蔗糖溶液或兩種密度的氯化銫溶液來制備。樣品一般鋪在溶液的表面，然后開始離心。

在實(shí)驗(yàn)方法上也可以采用平衡密度梯度法，在這種離心法中，介質(zhì)的梯度不是預(yù)先配制，而是在離心過程中，由于離心力的作用而逐漸形成。樣品物質(zhì)和氯化銫的濃鹽溶液充分混合均勻，離心開始之后，銫鹽由于離心力的作用，自離心管口至離心管底形成連續(xù)遞增的密度梯度。生物樣品中不同組分物質(zhì)在離心過程中沉降或上浮以尋找與自身密度相同的溶液密度梯度區(qū)帶，不同的物質(zhì)zui終到達(dá)相應(yīng)的區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分離。這種方法依賴于在離心場的作用下低分子量的銫鹽密度梯度的形成，一般需要長時(shí)間的離心（2~3天）。顯然，樣品物質(zhì)的密度應(yīng)介于介質(zhì)梯度中zui大和zui小密度之間，否則，樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。

無論是采用哪種操作方式，zui終都要分別收集處在每一區(qū)帶的樣品組分，一般可采用下述兩種方法實(shí)現(xiàn)：

（1）穿刺法

這是方便而又理想的部分收集方法。用一根金屬空心針從離心管底刺人管內(nèi)，不同區(qū)帶內(nèi)的組分自下而上地先后從針管內(nèi)分別流出，然后用部分收集器分別收集。

（2）取代法

在離心管口加一個(gè)帶有收集導(dǎo)管的塞子，塞子上同時(shí)裝有一根輸液導(dǎo)管插入離心管的管底，從輸液管中注入高密度的離心介質(zhì)．其密度高于離心管中所形成的zui大密度。當(dāng)取代液不斷注入時(shí)離心管中的溶液逐漸上升，并不斷從收集導(dǎo)管中流出，然后用部分收集器分別收集。